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孔雀石绿、硝基呋喃代谢物、氯霉素残留合检前处理
液相色谱-串联质谱法
1 应用范围
本方法规定了水产品(鱼类、虾蟹类和贝类）中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、硝基呋喃代谢物AMOZ、SEM、AHD和AOZ、氯霉素残留合检的液相色谱-串联质谱快筛方法。
2 检测原理
由于水产品中孔雀石绿、硝基呋喃代谢物、氯霉素违禁类药物在肌肉组织中的特殊残留形式及其低下限的标准规定，前处理方法存在前处理时间长、操作步骤繁琐、检测成本高等多年来尚未解决的问题。本方法可先将硝基呋喃代谢物在10 min内快速衍生，衍生化产物可和孔雀石绿、结晶紫、氯霉素共同被另一种试剂萃取，萃取液经固相萃取净化后，采用液相色谱-质谱联用仪检测，内标法定量。该方法具有以下创新点：
2.1 新型衍生化技术：可将硝基呋喃代谢物的衍生时间由原有16小时缩短至10 min内。
2.2 合检技术：一次性前处理可同时检测三大类残留药物，降低检测成本，提高检测效率。
2.3 将前处理时间缩短至1小时左右。
2.4 试剂用量少，对环境污染小，同时对操作人员的健康危害小。
2.5 操作简便、快速，结果稳定可靠。
3 试剂与材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 快速检测试剂盒
规格： 20样/盒
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名称 |
数量 |
名称 |
数量 |
名称 |
数量 |
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检测试剂A |
2瓶 |
检测试剂B |
2瓶 |
衍生化试剂 |
2瓶 |
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提取剂1 |
20管 |
提取剂2 |
4瓶 |
固相萃取柱 |
20支 |
4 仪器和设备
4.1 绞肉机/均质机、离心管架、天平、移液枪、超声波提取器、振荡器、离心机、可调式旋涡混合器、氮吹仪。
4.2 50 mL离心管、5 mL离心管。
4.3 微孔滤膜：0.2 μm，相。
4.4 液相色谱-串联质谱仪。
5 样品制备
Ø 称取5.0 g绞碎或均质后的组织样品于50 mL离心管中，加入3.0 mL检测试剂A，1.0 mL衍生化试剂，充分混匀，置于65 ℃超声波提取器中，超声20 min（期间摇匀2~3次）。
Ø 取出后加入2.5 mL检测试剂B，振荡2 min混匀；再加入1管提取剂1、5.0 mL提取剂2，振荡10 min，8000 r/min离心5 min。
Ø 用5.0 mL提取剂2活化固相萃取柱，取3.0 mL上清液（切勿取到下层）过活化后的固相萃取柱，取一支5 mL离心管接收流出液备用，并挤干柱体。用1.0 mL乙腈-乙酸铵缓冲溶液（3.18）洗脱柱子，并另取一支5 mL离心管收集洗脱液，摇动使之混合均匀备用。
硝基呋喃代谢物、氯霉素待测液：
Ø 从洗脱液管中准确移取0.5 mL洗脱液加入到流出液管中，50 ℃下氮气吹干，残渣用1.0 mL 水溶解，再用1.0 mL正己烷去除油脂（有需要可以萃取2次），下层水相即为硝基呋喃代谢物和氯霉素的待测液，过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
孔雀石绿待测液：
Ø 从洗脱液管中准确移取0.3 mL洗脱液与0.3 mL乙酸铵缓冲溶液（3.17）混匀，得到孔雀石绿的待测液，过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
6 测定
按实验室现用的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、硝基呋喃代谢物和氯霉素的液相色谱-质谱条件测定即可；如有需要，可联系生产商索要可供参考的仪器条件。
7 检出限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫检出限均为0.5 µg/kg；硝基呋喃代谢物AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为0.5 µg /kg；氯霉素检出限为0.1 µg/kg。
8 含量计算关键点（分取比例）
8.1 孔雀石绿的分取比例是3/5，用乙酸铵缓冲液稀释一倍，相当于3/10；
8.2 AOZ、AHD、SEM的分取比例是3/5，AMOZ的分取比例是3/10；
8.3 氯霉素的分取比例是3/5。
9 注意事项
9.1 上机测定时，及时进样孔雀石绿；样品前处理及检测过程中，孔雀石绿和隐色孔雀石绿可能会发生相互转化，出具的检测结果应为二者检出量之和。
9.2 做孔雀石绿、结晶紫、硝基呋喃代谢物、氯霉素多项合检的时候，建议配制待检项目的混标，以防向样品中加入较多的溶剂，影响提取效率，单个样品的加标体积不超过100 µL为宜。